氨基比林-N-脱甲基酶(AND)试剂盒说明书
分光光度法 50管/24样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中,尤其是药物和毒物,具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要一员,相当于CYP3A4亚型,与药物的去甲基化反应密切相关。
测定原理:
AND催化氨基比林释放甲醛,通过Nash比色法测定甲醛含量,即可计算出AND活性。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、普通离心机,超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、蒸馏水、无水乙醇和冰。
试剂组成和配制:
试剂一:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加50mL蒸馏水充分溶解。
试剂二:液体×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶(棕色瓶),4℃避光保存。临用前加入2.6 mL无水乙醇,充分溶解。
试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入2.6 mL蒸馏水,充分溶解。
试剂五:粉剂×1瓶,室温保存。临用前加蒸馏水10mL充分溶解。
试剂六:液体×1瓶,室温保存。
试剂七:液体×1瓶,4℃保存。
标准液:液体×1瓶,-20℃保存。临用前取1.5 mL EP 管,加入10μl标准液,加990μl蒸馏水,混匀即为0.05 mmol/L标准甲醛溶液,4℃保存。
粗酶液提取:
1、除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约0.5g组织,加入1 mL试剂一,冰上充分研磨,10 000g 4℃离心30min,取上清液转入超速离心管。
2、粗制微粒体:4℃,100 000g,离心60min,弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1mL试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100 000g离心30min,弃上清液。
4、最终微粒体:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5 mL,盖紧后充分震荡溶解,即粗酶液,待测。该待测液需当天使用。
AND活性测定操作:
1. 分光光度计预热30 min,调节波长到412 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。
3. 对照管:取1支EP管,加入50μL粗酶液,850μL试剂二,50μL试剂三,50μL蒸馏水,混匀后置于37℃水浴保温30min;立即加入175μL试剂五,混匀后置于冰浴中5min;取出后加入175μL试剂六,混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取新的EP管,加入500μL上清液,500μL试剂七,混匀后60℃
水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A对照管。
4. 测定管:取1支EP管,加入50μL粗酶液,850μL试剂二,50μL试剂三,50μL试剂四,混匀后置于37℃水浴保温30min;立即加入175μL试剂五,混匀后置于冰浴中5min;取出后加入175μL试剂六,混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取1支新EP管,加入500μL上清液,500μL试剂七,混匀后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A测定管。
5. 标准管:取1支EP管,加入500μL标准品,500μL试剂七,混匀后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A标准管。
注意:每个样品都需要做对照管。
AND活性计算:
(1).按照蛋白浓度计算:
活性单位定义:37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
AND活性(nmol/min/mg prot)= C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T
= 45×(A测定管-A空白管)÷A标准管÷Cpr
(2).按照样本质量计算:
活性单位定义:37℃中每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
AND活性(nmol/min/g 鲜重)= C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T
= 45×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷W
C标准品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V标准品:500μL=0.0005 L;稀释倍数:V反总÷V上清液=(50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白质浓度mg/mL,需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒;V样:加入粗酶液体积,50μL=0.05mL;W:样本质量,g ;T:反应时间,30min。
注意事项:
1、粗酶液需在当日完成测定,如需保存,则向粗酶液提取步骤3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油,分装后,-80℃保存;
2、试剂三和试剂四需临用前配制,如当天没有用完,4℃避光保存,可用1周;
3、粗酶液可直接用于蛋白浓度测定,建议用BCA法测蛋白含量。