红霉素-N-脱甲基酶(Erythromycin N-demethylase,ERND)试剂盒说明书
分光光度法 50管/24样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的酶系,在外源物质代谢中,尤其是药物和毒物的代谢,具有重要作用。ERND在P450酶系中相当于CYP2B亚型,与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用,也可使某些药物经CYP2B代谢活化。
测定原理:
ERND催化红霉素释放甲醛,通过Nash比色测定甲醛含量,即可计算出ERND活性。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、普通离心机,超速离心机、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、蒸馏水和冰。
试剂组成和配制:
试剂一:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加50 mL蒸馏水溶解。
试剂二:液体×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加2.6 mL蒸馏水,充分溶解。
试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加2.6 mL蒸馏水,充分溶解。
试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前,加蒸馏水9 mL充分溶解。
试剂六:液体×1瓶,4℃保存。
试剂七:液体×1瓶,4℃保存。
标准液:液体×1瓶,-20℃保存。临用前取1.5 mL EP 管,加入10μl标准液,加990μl蒸馏水,混匀即为0.05 mmol/L标准甲醛溶液,4℃保存。
粗酶液提取:
1、除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约0.5g组织,加入1mL试剂一,冰上充分研磨,10 000g 4℃离心30min,取上清液,转入超速离心管中。
2、粗制微粒体:100 000g,4℃,离心60min,弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1mL试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100 000g离心30min,弃上清液。
4、最终微粒体:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL,充分震荡溶解,即粗酶液,待测。该待测液需当天使用。
测定操作:
1. 分光光度计预热30 min以上,调节波长到412 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二置于37℃水浴中预热30 min。
3. 对照管:取1支EP管,加入50μL粗酶液,850μL试剂二,50μL试剂三,50μL蒸馏水,混匀后置于37℃水浴保温30min;立即加入175μL试剂五,混匀后置于冰浴中5min;取出后加入175μL试剂六,混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取新的EP管,加入500μL上清液,500μL试剂七,混匀后60℃
水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A对照管。
4. 测定管:取1支EP管,加入50μL粗酶液,850μL试剂二,50μL试剂三,50μL试剂四,混匀后置于37℃水浴保温30min;立即加入175μL试剂五,混匀后置于冰浴中5min;取出后加入175μL试剂六,混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取1支新EP管,加入500μL上清液,500μL试剂七,混匀后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A测定管。
5. 标准管:取1支EP管,加入500μL标准品,500μL试剂七,混匀后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A标准管。
注意:每个样品都需要做对照管。
ERND活性计算公式:
(1) 按照蛋白浓度计算:
活性单位定义:37℃下,每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
ERND活性(nmol/min/mg prot) = C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T
= 45×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷Cpr。
(2). 按照样本质量计算:
活性单位定义:37℃下,每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
ERND活性(nmol/min/g 鲜重) = C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T
= 45×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷W
C标准品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V标准品:500μL=0.0005 L;稀释倍数:V反总÷V上清液=(50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mL,需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒;V样:加入粗酶液体积,50μL=0.05mL;W:样本质量,g;T:催化反应时间,30min。