谷氨酸(glutamic acid,Glu)含量测定试剂盒

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谷氨酸(glutamic acidGlu)含量测定试剂盒说明书

                                  分光光度法50/48

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

Gu广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,不仅是组成蛋白质的20种氨基酸之一,而且通过转氨基作用参与多种氨基酸合成,是生物体内主要氨基来源之一。此外,Glu还是味精的主要有效成分,常用做食品添加剂以及香料生产。

测定原理:

利用专用提取液提取,然后用显色剂进行显色,显色后在570nm下进行测定

自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:液体100mL×1瓶,4保存;

试剂粉剂×1瓶, 4保存;临用前加入10mL蒸馏水,充分混匀溶解,用不完的试剂仍 4保存

谷氨酸提取:

1细菌或培养细胞样品:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~10001的比例(建议1000万细菌或细胞加入2mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 常温离心10min,取上清,置冰上待测。

2组织样品按照组织质量(g:试剂一体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.2g组织,加入2mL试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 常温离心10min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)或细胞培养液样品:按照血清(浆)或细胞培养液体积(mL:试剂一体积(mL)15~10的比例(建议0.2mL血清(浆)或者细胞培养液加入2mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g 常温离心10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至570nm,蒸馏水调零。

2、 在有盖EP管中加入下列试剂

试剂名称(μL

测定管

对照管

样本

1000


试剂一


1000

试剂二

200

200

混匀,90℃水浴20min(盖紧,以防止水分散失),流水冷却,于570nm波长处比色,△A=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。

谷氨酸含量计算:

1标准条件下测定回归方程为y = 0.0074x- 0.5255x谷氨酸含量(µg/mL),y吸光值。

2按照血清(浆)或者细胞培养液体积计算

谷氨酸含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V3×V1÷V2=1351×(△A+0.5255)

3按照蛋白浓度计算

谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V1×Cpr)=135.1×(△A+0.5255) ÷Cpr

4按照样质量计算

谷氨酸含量(µg/g鲜重)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(W ×V1÷V2)=270.2×(△A+0.5255) ÷W

5、按照细菌或细胞密度计算

谷氨酸含量(μg/104 cell)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(1000×V1÷V2)=0.27×(△A+0.5255)

V1:加入反应体系中样本体积,1mLV2:加入提取液体积,2 mLV3:加入血清(浆)或细胞培养液体积0.2 mL Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样质量,g1000:细菌或细胞总数,1000万。

注意:

1、该试剂盒仅适用于发酵液或组织中谷氨酸含量测定,检测下限为100µg/mL

2、标准曲线线性范围为:100µg/mL -600µg/mL

3、ΔA线性范围为:0.01-2若大于2则需要将上清液用试剂一稀释至适当倍数后测定,计算公式中乘以相应稀释倍数。