原位邻位连接试剂盒（滚环扩增法）
原位邻位连接试剂盒（滚环扩增法）
CAT#:BFJ100711
产品介绍：本产品是基于邻近连接和滚环扩增的原位蛋白质A-蛋白质B 相互作用检测试剂盒，其原理示意图如下：
本产品具有下列特点：
一站式，含有邻位连接和RCA 扩增试剂盒，不需要单独准备各成份。
操作流程经过进行优化，用户不需要花费时间优化。
起始材料为新鲜制备的细胞切片，不能用于悬浮细胞。
能原位可视化显示亚细胞水平的蛋白质 A-蛋白质 B 的相互作用或修饰前-修饰后蛋白的位置关系，检测的邻近距离范围为 40 nm 左右，分辨率可达到单分子水平。
荧光染料为FITC，如果需要其他荧光，需定制。
既能检测到稳定的，也能检测到短暂的蛋白质 A-蛋白质B 互作，不需要重组表达一个或两个互作蛋白质。
本试剂盒提供的两个 OAC（Oligo-抗体偶联物）分别识别小鼠和兔子的一抗，故用户自备的一抗必须是源于小鼠和兔子的，否则无法使用本试剂盒。
本产品可以进行 30 次邻位连接和RCA 扩增，不包括切片制备试剂。
本产品只能用于科研。
产品组成：
名称 | 规格 |
OAC A | 30 μL |
OAC B | 30 μL |
2×PLA DNA 连接液 | 300 μL |
PLA 桥连 DNA（干粉） | 30 T |
PLA DNA 连接酶 | 30 μL |
PLA-RCA MasterMix | 30 T |
PLA-RCA DNA 聚合酶 | 20 μL |
PLA-RCA 扩增产物探针（干粉） | 30 T |
PLA 复染液 | 300 μL |
自备试剂 ：分别来于小鼠和兔的识别两个互作蛋白的一抗，抗体稀释液，细胞固定和穿透相关试剂
使用方法：一: 预实验优化条件
1. 用户必须先用常规免疫荧光方法，检测所用识别两个互作蛋白质的抗体对能够进行常规的荧光检测。一个抗体必须来源于大鼠，另一个抗体必须来源于小鼠。只有在常规免疫荧光检测成功后，才能进入下一步操作。
二、切片制备（本试剂盒不含相关试剂，下面操作和s 只是示例）。
细胞固定： 4% PFA in PBS 常温固定 15 分钟，PBS 洗涤 3 次。
细胞渗透：0.5% Tritin X-100 和 1% BSA（in PBS）37℃渗透 30 分钟。
洗涤：PBS 洗涤 3 次，最后用 5 μL PBS 覆盖切片防止干燥。
三、邻位连接
首次使用本产品时，或在后续实验遇到问题需要分析原因时，用户可以根据最可能
出问题的环节，选择设置下列 7 个对照中的一个或几个：无一抗对照（包括不加两个对照中的一个或两个一抗抗体均不加），不加PLA DNA 连接酶对照，不加 DNA聚合酶对照，不加桥连 DNA 对照，不加PLA-RCA 扩增产物探针对照。
在切片上加入两种 OAC A 和 OAC B 各 5 μL，室温放置 1 小时。注意：AOC 的浓度非常关键，而它又跟靶蛋白的丰度有关，而丰度往往未知，故需预实验确定。
洗涤：用TBS-T 洗涤 4 次，每次 15 分钟。最后用 5 μL PBS 覆盖切片防止干燥。
配制PLA 连接工作液：在一干净的 1.5 mL 塑料离心管中按下表新鲜配制，用多少配制多少。首次配制时需要在 PLA 桥连 DNA（干粉）管中加入 300 μL 2×PLA DNA连接液，涡旋 30 秒混匀，短暂离心得 2×PLA DNA 连接液（含桥连 DNA），放冰上待用。没用完的此溶液需要放-20℃保存。
成份 | 1 个样本的用量 | N 个样本的用量 |
2×PLA DNA 连接液（含桥连 DNA） | 9 μL | 9 μL×（N+1） |
PLA DNA 连接酶 | 1 μL | 1 μL×（N+1） |
合计 | 10 μL | 10 μL×（N+1） |
9.将PLA 连接工作液立即加到切片上，每张切片加入 10 μL，30℃保温 45 分钟。
10.洗涤：用TBS-T 洗涤 3 次，每次 1 分钟。最后用 5 μL PBS 覆盖切片防止干燥。
四、RCA 扩增
11.配制RCA 扩增工作液：在一干净的 1.5 mL 塑料离心管中按下表新鲜配制，用多少配制多少。首次配制时需要在 PLA 桥连 DNA（干粉）管中加入 60 μL 超纯水，涡旋 30 秒混匀，短暂离心得PLA 桥连 DNA 溶液，放冰上待用。没用完的PLA 桥连 DNA 溶液需要放-20℃保存。
成份 | 1 个样本的用量 | N 个样本的用量 |
PLA-RCA 反应液 | 9 μL | 9 μL×（N+1） |
PLA-RCA DNA 聚合酶 | 1 μL | 1 μL×（N+1） |
合计 | 10 μL | 10 μL×（N+1） |
12.将上步所得RCA 工作液加到切片上，每张切片加入 10 μL，32℃保温 2 小时。
13.洗涤：用TBS-T 洗涤 2 次，每次 1 分钟。最后用 5 μL PBS 覆盖切片防止干燥。
五、荧光检测
14.配制PLA 荧光检测工作液：在一干净的 1.5 mL 塑料离心管中按下表新鲜配制，用多少配制多少。首次配制时需要在PLA 荧光检测试剂A（干粉）管中加入300 μL PLA复染液，涡旋振荡 30 秒混匀，得PLA 荧光检测液，放冰上待用。没用完的PLA 荧光检测液需要放-20℃保存。
15.将PLA 荧光检测液加到切片上，每张切片加入 10 μL，32℃保温 30 分钟。
16.洗涤：用TBS-T 洗涤 3 次，每次 1 分钟。
17.荧光显微镜下检测。 在 490 nm 激发波长-520 nm 发射波长下检测到的信号代表 RCA 扩增产物（表示蛋白互作位点）。在 360 nm 激发波长-460 nm 发射波长下检测到的结构为细胞核，依此可准确判断蛋白互作或翻译后修饰发生在核内还是核周。在 500 nm 激发波长-520 nm 发射波长下检测到的结构是细胞质F-actin 网络，依此作为细胞内部的地图，可精确判断 PLA 信号点是位于细胞膜附近、细胞质中，还是富集在某种特定的骨架结构周围。