念珠菌通用染料法PCR试剂盒

念珠菌通用染料法PCR试剂盒

Candida spp. SYBR PCR Kit

BFJ100342-50T

产品及特点：本产品是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测念珠菌的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2. 引物经过优化，灵敏度高，分析灵敏度可以达到100拷贝/反应。

3. 提供阳性对照，便于制备标准曲线和排除无效实验结果。

4. 特异性高，引物是根据念珠菌DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。

5. 本产品足够50次20 μL体系的染料法荧光定量PCR反应。

6. 既可用于定性，也可用于定量。用于定量时线性范围至少5个数量级。

7. 本产品只能用于科研。

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂：样品 DNA。

组成：     

使用方法：

一、稀释标准曲线样品（以 1E1-1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。

1.标记 6 个离心管，分别为 6、5、4、3、2、1。

2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头（下同）。

3.在 6 号管中加入 5 μL 1E7 拷贝/μL 的阳性对照（试剂盒提供），充分震荡 1 分钟，得 1E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1E6 拷贝/μL 的阳性对照（上步稀释所得），充分震荡 1 分钟，得 1E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 1E5 拷贝/μL 的阳性对照（上步稀释所得），充分震荡 1 分钟，得 1E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7.如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），

一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10 μL 第 6 步所得的第 4 号稀释液（1E4拷贝/μL）再加上一定量的水使总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品 DNA 提取试剂盒兼容，也可使用本公司的免提取核酸释放剂。

三、染料法 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于PCR 阳性对照（用第 6 步第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

四、数据处理

12.通过溶解曲线分析排除无效数据。有 Ct 值，但 Tm 值跟阳性对照 Tm 不一样的结果，归为假阳性，此样本 Ct 数据无效，不予以分析。Tm 跟阳性对照 Tm 一致的，为有效 Ct。

13.如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和 PCR 阴性对照）的溶解曲线所得 Tm 值跟阳性对照的 Tm 值一样，说明环境或试剂可能有过去的 PCR 扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。如果两种阳性对照（样品制备阴性对照和 PCR 阴性对照）无 Ct 值则无效。

14.如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和 PCR 阴性对照）是假阳性，有 Ct 但 Tm 与阳性样本不同，实验有效可以继续分析其它样品有效数据。

15.对定量检测，以阳性对照样品的浓度的 log 值为横轴，以有效 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再换算出待测样品的 DNA 浓度。

对定性检测，则有有效 Ct 值的为阳性，无有效 Ct 值的为阴性。