牛诺如病毒染料法RT-PCR试剂盒

牛诺如病毒(Bovine Norovirus，BONOV)是一种杯状病毒科诺如病毒属的病毒，为无包膜的单股正链RNA病毒，基因组全长为7500-7700 nt。该病毒主要通过粪口途径传播，传播介质包括污染的饲料、水源或感染动物的排泄物，可引发腹泻、呕吐、食欲下降等急性胃肠炎症状，它的主要宿主是牛。牛诺如病毒对畜牧业的发展有较大危害。因此，快速检测牛诺如病毒具有重要的意义。为此，本公司以染料法RT-PCR技术为基础开发了牛诺如病毒的检测试剂盒，它具有下列特点：

1. 一站式，用户不需要单独准备每种成分，只需要提供RNA样品。

2. 基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到100拷贝/反应。

3. 根据牛诺如病毒的保守序列设计引物，具有良好的特异性，不会跟其它生物的RNA发生交叉反应。

4. 使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5. 本产品可用于定性检测，也可用于定量检测。定量检测时线性范围至少有5个数量级。

6. 本产品足够50次20 μL体系的RT-PCR反应。

7. 本产品只能用于科研。

使用方法 一、稀释阳性对照（以1E1-1E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头（下同）。

2. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。 二、样品RNA的制备

5. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1E4拷贝/μL，10 μL相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照，加水后其总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样品体积一样。可以用水作为核酸制备的阴性对照NC。

6. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒样品RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。 三、设置RT-PCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）

7. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

8. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）

9. 上机后按下面参数进行RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）

四、数据处理

10. 通过溶解曲线分析排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品结果，归为假阳性，此样本Ct数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。

11. 如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和PCR阴性对照）的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。如果两种阳性对照（样品制备阴性对照和PCR阴性对照）无Ct值则无效。

12. 如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照）是假阳性，有Ct但Tm与阳性样本不同，实验有效可以继续分析其它样品有效数据。

13. 对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再换算出待测样品的RNA浓度。

14. 对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。