牛病毒性腹泻病毒染料法qRT-PCR试剂盒

牛病毒性腹泻病毒染料法qRT-PCR试剂盒

Bovine Viral Diarrhea Virus（BVDV）SYBR qRT-PCR Kit

产品介绍：

本公司以染料法qRT-PCR技术为基础开发了牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的检测试剂盒，它具有下列特点：

1.一站式，用户不需要单独准备每种成分，只需要提供RNA样品。

2.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到100拷贝/反应。

3.根据牛病毒性腹泻病毒的保守序列设计引物，具有良好的特异性，不会跟其它生物的RNA发生交叉反应。

4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5.本产品可用于定性检测，也可用于定量检测。定量检测时线性范围至少有5个数量级。

6.本产品足够50次20 μL体系的qRT-PCR反应。

本产品只能用于科研。。

产品组份：

2×SYBR qRT-PCR 缓冲液        500 μL

SYBR qRT-PCR酶混合液v2        50 μL

荧光PCR专用模板稀释液        1 mL

BVDV qRT-PCR引物干粉        50次

BVDV qRT-PCR

阳性对照（1E7拷贝/μL）        50 μL

使用手册                                                 1份

注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入110 μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要单独放置。

自备试剂： 样品RNA

使用方法：

一、稀释阳性对照（以1E1-1E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。

1.标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头（下同）。

2.换枪头，在6号管中加入5 μL 1E7拷贝/μL的阳性对照（试剂盒提供），充分震荡1分钟，得1E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3.换枪头，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL的阳性对照（上步稀释所得），充分震荡1分钟，得1E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4.重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

5.如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1E4拷贝/μL，10 μL相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照，加水后其总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样品体积一样。可以用水作为核酸制备的阴性对照NC。

6.用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒样品RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、设置RT-PCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）

7.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

8.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：

上机后按下面参数进行RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

四、数据处理

10.通过溶解曲线分析排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品结果，归为假阳性，此样本Ct数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。

11.如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和PCR阴性对照）的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。如果两种阳性对照（样品制备阴性对照和PCR阴性对照）无Ct值则无效。

12.如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照）是假阳性，有Ct但Tm与阳性样本不同，实验有效可以继续分析其它样品有效数据。

13.对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再换算出待测样品的RNA浓度。

对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。