高尔基体膜蛋白提取试剂盒

高尔基体膜蛋白提取试剂盒

货号：01256B

2-8℃ 保存。

【注】：

试剂瓶开盖后各组份按要求条件保存。

拆封后请尽快使用完！

规格50 T

组份 A：高尔基体膜蛋白提取液A25 ml50 ml

组份 B：高尔基体膜蛋白提取液B25 ml50 ml

组份 C：高尔基体膜蛋白提取液C10 ml20 ml

组份 D：高尔基体膜蛋白提取液D10 ml20 ml

组份 E：蛋白酶抑制剂混合物100 μl200 μl

使用说明书11

各组份储存条件：

蛋白提取液 2-8℃保存；蛋白酶抑制剂-20℃保存。

【注】：

蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以 2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。

蛋白酶抑制剂在 2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或 37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

试剂拆封后请尽快使用完！

一年。

【注】：

有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期。

试剂拆封后请尽快使用完！

高尔基体膜蛋白提取试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的高尔基体膜蛋白的提取。

本试剂盒提取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift 凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。

本试剂盒中不含有 EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。

本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于 2D 电泳，需要除盐后再用于 2D 电泳。如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用公司其他货号的蛋白提取试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于 2D 电泳，用脱盐柱脱盐处理（相关产品 01848B）。

高尔基体（Golgi apparatus, Golgi bodies）是由许多扁平的囊泡构成的以分泌为主要功能的细胞器。又称高尔基器或高尔基复合体；高尔基体是由数个扁平囊泡堆在一起形成的高度有极性的细胞器。常分布于内质网与细胞膜之间，呈弓形或半球形，凸出的一面对着内质网称为形成面（forming face）或顺面（cis face）。凹进的一面对着质膜称为成熟面（mature face）或反面（trans face）。顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡，在具有极性的细胞中，高尔基体常大量分布于分泌端的细胞质中。因其看上极像滑面内质网，因此有科学家认为它是由滑面内质网进化而来的。

高尔基体中的酶主要有糖基转移酶、磺基-糖基转移酶、氧化还原酶、磷酸酶、蛋白激酶、甘露糖苷酶、转移酶和磷脂酶等不同的类型。高尔基体的主要功能将内质网合成的蛋白质进行加工、对比分类、与包装，然后分门别类地送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。

产品特点：

使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。

提取过程简单方便，将蛋白提取的时间缩短至 30 分钟-1 小时。

含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。

紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。

总蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。

蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含 6 种独立的蛋白酶抑制剂 AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、 E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

货号试剂盒名称样本下游应用

01671B溶酶体提取试剂盒细胞组织根据需要使用

01689B核糖体提取试剂盒细胞组织根据需要使用

01655B线粒体提取试剂盒细胞组织根据需要使用

01667B细胞核提取试剂盒细胞组织根据需要使用

01673B高尔基体提取试剂盒细胞组织根据需要使用

01679B内质网提取试剂盒细胞组织根据需要使用

01062B总蛋白提取试剂盒动物细胞组织WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA,

purification,kinaseassays,activity assays,reporter assays,amine reactive labeling,etc.

01084B磷酸化蛋白富集试剂盒动物细胞组织磷酸化蛋白质谱,2-D,IEF, WB,IP,ELISA,EMSA,purification,kinase assays,activity assays, reporter assays,amine

reactive labeling,etc.

01064B总蛋白提取试剂盒

（蛋白质相互作用适用）动物细胞组织Pull-down, co-IP, IP, WB,ELISA,EMSA,purification,kinase assays,activity assays, reporter assays,amine

reactive labeling,etc.

01396B总蛋白提取试剂盒

（2-D电泳用）动物细胞

组织2-D,IEF,

WB,purification,etc.

01454B总蛋白提取试剂盒

（离心柱法）动物细胞组织WB,IP,ELISA,EMSA,purification,kinase assays,activity assays, reporter assays,amine

reactive labeling,etc.

01470B总蛋白提取试剂盒

（离心柱，2-D电泳用）动物细胞

组织2-D,IEF,

WB,purification,etc.

01486B总蛋白提取试剂盒

（无去污剂）动物细胞组织蛋白质谱,2-D,IEF, WB,IP,ELISA,EMSA,purification,kinase assays,activity assays, reporter assays,amine

reactive labeling,etc.

01506B总蛋白提取试剂盒

（蛋白组、质谱适用）动物细胞组织蛋白质谱,2-D,IEF, Pull-down, co-IP, WB,IP,ELISA,EMSA,purification,kinase assays,activity assays, reporter assays,amine

reactive labeling,etc.

涡旋混匀器

移液器

冰箱

冰盒

试剂准备：

PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））（phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）

蛋白定量试剂盒

耗材准备：

离心管

吸头

一次性手套

使用注意事项：

旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

最好使用 Dounce 匀浆器匀浆，如果没有 Dounce 匀浆器，也可用普通玻璃匀浆器匀浆，但是高尔基体蛋白回收率会下降。

用Dounce 匀浆器匀浆是高尔基体膜蛋白提取的关键的步骤，故匀浆前最好先通过预实验确定不同组织样本的最适匀浆次数，方法是每匀浆 5-10 次后，取 2-3 μl 匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到 20%以下为佳。此镜检步骤非必须步骤，但是会影响高尔基体膜蛋白的回收率。在样本极难获取的实验中，务必做镜检。

提取液C 在使用前须一直置于 2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。

膜蛋白电泳时loading buffer 应该避免煮沸。

膜蛋白电泳时可以提高loading buffer 的 SDS 含量。

细胞高尔基体膜蛋白提取：

1.提取液制备：

每 200 μl 冷的蛋白提取液 C 中加入 1 μl 蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

每 200 μl 冷的蛋白提取液 D 中加入 1 μl 蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】：

根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。

加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制

剂。

提取液C 在使用前须一直置于 2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。

以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

2.取 1-2×107 个细胞，在 4℃，500×g 条件下离心 2-3 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

3.用冷 PBS 洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

4.加入 500 μl 冷的试剂 A，置冰上 10 分钟。

5.用 Dounce 匀浆器匀浆充分匀浆。

【注】：

先用Dounce 匀浆器的松型槌初步匀浆 10-20 次，再用紧型槌匀浆 20-30 次。

每上下一个来回为一次。

6.然后在 4℃，1000×g 力条件下离心 5 分钟。

7.弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。

8.在 4℃，3000×g 力条件下离心 10 分钟。

9.弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。

10.在 4℃，10000×g 力条件下离心 10 分钟。

11.弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。

12.在 4℃，25000×g 力条件下离心 30 分钟。弃上清。

13.在沉淀中加入 400 μl 冷的试剂 B，混匀。

14.在 4℃，25000×g 力条件下离心 30 分钟。

15.弃上清，沉淀中加入 100-200 μl 冷的蛋白提取液 C，充分混匀。

【注】：

提取液C 使用前必须保持在 2-8℃条件，否则严重影响膜蛋白回收率。

16.在 2-8℃条件下振荡 30-40 分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。

【注】：

此步骤必须在 2-8℃处理，否则严重影响膜蛋白回收率。

用振荡器/摇床的较低转速，保持液体晃动即可。

没有 2-8℃振荡条件也可以不振荡，置 2-8℃静置，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。

17.在 4℃，12000×g 条件下离心 5 分钟。弃沉淀，收集上清。

18.将上清吸入另一干净离心管，在 37℃水浴 10 分钟。

19.在 37℃，1000×g 力离心 5 分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为

20-30μl。

【注】：

此步骤必须在 37℃条件下离心。

没有 37℃离心条件也可以不离心，稍微延长 37℃水浴时间，至液体澄清，分层清晰。

20.小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。

【注】：

上层部分为高尔基体内非膜蛋白的蛋白。

待下游目的膜蛋白实验完成后在丢弃此部分。膜蛋白萃取不完全时此部分蛋白仍可

以进行再次提取膜蛋白。

21.用 50-100 μl 冷的试剂 D 膜蛋白溶解液溶解下层高尔基体膜蛋白部分，即得高尔基体膜蛋白。

【注】：

必须用冷的试剂D 溶解膜蛋白。

膜蛋白有时不能马上溶解，产生乳白色现象，此时可以置于 2-8℃条件静置后再次轻轻吹打混匀即可。

膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于 4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀几次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。

于 4℃静置直至管底透明粘稠状物完全溶解。

22.将高尔基体膜蛋白样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。

【注】：

建议用 BCA 法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。

蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

组织高尔基体膜蛋白提取：

1.提取液制备：

每 200 μl 冷的蛋白提取液 C 中加入 1 μl 蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

每 200 μl 冷的蛋白提取液 D 中加入 1 μl 蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】：

根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。

加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。

以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

2.取 50-100 mg 新鲜动物组织样本，用 PBS 洗涤干净。

3.用剪刀尽可能剪碎，用冷 PBS 洗涤两次。

4.加入 500 μl 冷的试剂 A，置冰上 10 分钟。

5.用 Dounce 匀浆器充分匀浆 30-40 下，至无明显固体团块。

【注】：

先用Dounce 匀浆器的松型槌初步匀浆 10-20 次，再用紧型槌匀浆 20-30 次。

每上下一个来回为一次。

6.然后在 4℃，1000×g 力条件下离心 5 分钟。

7.弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。

8.在 4℃，3000×g 力条件下离心 10 分钟。

9.弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。

10.在 4℃，10000×g 力条件下离心 10 分钟。

11.弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。

12.在 4℃，25000×g 力条件下离心 30 分钟。弃上清。

13.在沉淀中加入 400μl 冷的试剂 B，混匀。

14.在 4℃，25000×g 力条件下离心 30 分钟。

15.弃上清，沉淀中加入 100-200 μl 冷的蛋白提取液 C，混匀。

【注】：

提取液C 使用前必须保持在 2-8℃条件，否则严重影响膜蛋白回收率。

16.在 4℃条件下振荡 30-40 分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。

【注】：

此步骤必须在 2-8℃处理，否则严重影响膜蛋白回收率。

用振荡器/摇床的较低转速，保持液体晃动即可。

没有 2-8℃振荡条件也可以不振荡，置 2-8℃静置，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。

17.在 4℃，12000×g 条件下离心 5 分钟。弃沉淀，收集上清。

18.将上清吸入另一干净离心管，在 37℃水浴 10 分钟。

19.在 37℃，1000×g 力离心 5 分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为

20-30μl。

【注】：

此步骤必须在 37℃条件下离心。

没有 37℃离心条件也可以不离心，稍微延长 37℃水浴时间，至液体澄清，分层清晰。

20.小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。

【注】：

上层部分为高尔基体内非膜蛋白的蛋白。

待下游目的膜蛋白实验完成后在丢弃此部分。膜蛋白萃取不完全时此部分蛋白仍可以进行再次提取膜蛋白。

21.用 50-100 μl 冷的试剂 D 膜蛋白溶解液溶解下层高尔基体膜蛋白部分，即得高

尔基体膜蛋白。

【注】：

必须用冷的试剂D 溶解膜蛋白。

膜蛋白有时不能马上溶解，产生乳白色现象，此时可以置于 2-8℃条件静置后再次轻轻吹打混匀即可。

膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于 4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀几次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。

于 4℃静置直至管底透明粘稠状物完全溶解。

22.将高尔基体膜蛋白样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。

【注】：

建议用 BCA 法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。

蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

蛋白浓度低？

处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂 C 的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

用什么方法定量蛋白？

建议用 BCA 法。不适合用 Bradford 法，因为试剂 C 中含有干扰 Bradford 法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用 Bradford 法定量。

提取的蛋白具有活性吗？

本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

膜蛋白电泳没有条带？

膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。

膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。蛋白加 Loading buffer 后可以不用煮沸，采用 50℃保温 30 分钟。

蛋白 Loading buffer 中 SDS 终浓度含量可以提高至 3%-10%。

有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。

电泳时最好采用低电压低电流电泳。

膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。