大鼠线粒体DNA探针法荧光定量PCR试剂盒

CAT#: BFS6960

大 鼠 线 粒 体 D N A 探 针 法荧 光 定 量 P C R 试 剂 盒

R a t   M i t o c h o n d r i a l   D N A   P r o b e   q P C R   K i t

本试剂盒可用于检测大鼠线粒体 DNA。本产品是根据探针法荧光定量 PCR 原理开发的大鼠线粒体 DNA 检测试剂盒，它具有下列特点：

即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

引物等组分经过优化，灵敏度高。

提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

特异性高，引物是根据大鼠线粒体 DNADNA 序列高度保守区设计，不会跟其他样本的 DNA 发生交叉反应。

既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。

本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

本产品只能用于科研。

成分规格

保存条件

低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试

剂。

一、DNA 提取(样本制备区)

（选做）如果有 N 个样品待提取，最好设置 N+2 个提取，多出的是 PC（样品制备阳性对照）和 NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的 1000 倍稀释液 10μL 再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

用自选方法提取纯化样品 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

二、稀释标准曲线样品(样本制备区)

（由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样品或本试剂盒的其他成分）。

标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光模板稀释液，（最好用带芯枪头，下同）。

在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到 1×10E5 拷贝/μL 即可。

三、试剂配制(试剂准备区)

准备足量的 qPCR 管（样品管、阴性对照管、阳性对照管），向各 qPCR 管中分别加入下列成分。

转移至模板添加区。四、添加模板(模板添加区)

向 qPCR 管中分别加入 5 uL 模板，顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板、大鼠线粒体 DNA qPCR 阳性对照，离心 30 秒，立即进行扩增反应。

五、扩增反应(扩增及产物分析区)

将 qPCR 管放置在 qPCR 扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下：

六、结果分析

如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，推算出其浓度。

如果未制作标准曲线，按照如下标准判定结果：

阳性对照（1×10E5 拷贝/μL）结果：Ct 值<30，有明显指数增长，呈典型的 S 型曲线。

阴性对照结果：Ct 值>40 或无 Ct 值，无明显指数增长期和平台期。

样本检测结果：Ct 值<38，有明显指数增长，表明样本中检测出大鼠线粒体 DNA，结果为阳性；Ct 值>40 或无 Ct 值，表明样本中未检测出大鼠线粒体 DNA，结果为阴 性；Ct 值在 38-40 范围，应对样本进行复检，如重复实验结果 Ct 值仍在 38-40 范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。