重组蛋白不同标签的选择

蛋白质的检测方法最为应用广泛的是免疫分析，常用的方法有：WB（Western Blot）、ELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）、IP（Immunoprecipitation）等。

免疫分析需要将目标蛋白作为抗原，注射动物，然后从免疫血清中分离抗体，根据抗原-抗体间的免疫反应进行特异性检测。这种方法最大的缺陷就是每更换一个目标蛋白就要制

备一个对应的抗体，操作繁琐，成本昂贵。

融合标签的使用，使蛋白质免疫分析走向通用化和便利化。我们将特定的标签与目标蛋白融合后，两者是共同表达的，通过检测融合标签，可以得到目标蛋白的表达情况。蛋白

标签（Protein tag）技术是指利用基因克隆手段，将具有特定功能的多肽，蛋白质结构域，甚至完整蛋白质与目标蛋白融合在一起，以实现目标蛋白的表达纯化，检测和示踪等

应用的技术。蛋白标签融合已经成为蛋白质研究中最常用的技术之一。以下是几种常规蛋白纯化标签比较：

融合标签      大小（KD）          功能                                                                               是否切除

HIS                    0.84           有利纯化，能纯化可溶性/包涵体蛋白                             标签小，对蛋白无影响

GST                   26             增强蛋白可溶性，仅能纯化可溶性蛋白，屏蔽毒性蛋白     标签较大，影响较大

MBP                 44.4           增强蛋白可溶性，屏蔽毒性蛋白

NusA                55              增强蛋白可溶性，屏蔽毒性蛋白

SUMO              11.2           增强蛋白可溶性，屏蔽毒性蛋白

重组蛋白表达常用标签区别：

HIS标签

His标签是当前最为热门的标签蛋白之一。His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；

二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析（IMAC），对重组蛋白进行分离纯化。

Fc标签

Fc 片段通过 CH2-CH3 与 FcRn 结合并呈 pH 依赖性：在 pH 7.4 的生理条件下，FcRn 与Fc 不结合；在细胞内涵体 pH 6.0~6.5 的酸性条件下，两者结合，从而避免融合分子在细

胞内被溶酶体等快速降解。Fc融合蛋白可以通过 Fc 铰链区的二硫键连接形成稳定的二聚体，进一步通过对二硫键的基因工程改造和修饰，还可以使 Fc 融合蛋白聚集成六聚体复合物。

Fc 区域可以独立折叠，保证伴侣分子体内外的稳定性。

Flag-tag

Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

AviTag

是一个15个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，为了

纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。

SNAP-Tag

SNAP-Tag是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）获得。SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出

了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。

检测：生物素或各种颜色荧光的底物（如荧光素、若丹明）可渗透进入细胞，方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag融合蛋白的标记与检测。它们也可特异性地标记大肠杆菌，酵母和哺乳动

物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。

GST（谷胱甘肽巯基转移酶）

GST标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结

合的融合蛋白在非变性条件下用10mM还原型谷胱甘肽洗脱。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。

纯化：该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和树脂进行纯化。

如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

GFP

GFP（绿色萤光蛋白）是由下村修等人在水母中发现的。它在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。GFP标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于各种细胞类型，包括细

菌、酵母和哺乳动物细胞等，相应的GFP标签抗体也被广泛应用。GFP在检测蛋白表达、蛋白和细胞荧光示踪、研究蛋白质之间相互作用和构象变化中，起到了重要的作用。

c-Myc

C-Myc标签蛋白，是一个含11个氨基酸的小标签，它作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量

术中，可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

荧光素酶（luciferase）

来源于生物体内的荧光素，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶。这些荧光素酶作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，这种技术被称为报告基因检测法或萤光素

酶检测法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白标签不同，使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究启动子、miRNA 3'UTR克隆的功能与调控，因为它们

对目的基因的调控可以是渐变的，而不是简单的开和关两种状态。