原代细胞培养方法汇总(二)

原代细胞的复苏

细胞一般储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞复苏就是要把原本冷冻保存(冻存)着的细胞恢复到一般的生长状态，今天我们来看看原代细胞的复苏步骤。

　　一、检查

　　收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即处理告诉寄方。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70 °C，隔夜后，移到液氮罐保存)。

　　二、冷冻细胞解冻　

     方法一：

1、准备好37度水浴锅，预热至37度；

2、准备好T25培养瓶，加入10ml完全培养基（培养基量必须大于冻存液10倍体积）；

3、取出冻存细胞管，用一次性PE手套包裹冻存管（防止管内进水导致污染），迅速放于水浴锅内，于1min内融化完全；

4、取出冻存管，酒精喷洒消毒后擦干，置于超净台内；

5、吸取冻存管内细胞悬液，加入步骤2中准备好的T25培养瓶内，8字缓慢摇匀；

6、培养瓶放于37度CO2恒温培养箱内，静置培养24h，更换新鲜换培养基（注意贴壁细胞、悬浮细胞不同操作方法）。

     方法二：

1、准备好37度水浴锅，预热至37度；

2、准备好15ml无菌离心管，加入10ml完全培养基（培养基量必须大于冻存液10倍体积）；

3、准备好实验用培养板或培养器皿；

4、取出冻存细胞管，用PE手套包裹冻存管（防止管内进水导致污染），迅速放于水浴锅内，于1min内融化完全；

5、取出冻存管，酒精喷洒消毒后擦干，置于超净台内；

6、吸取冻存管内细胞悬液，加入步骤2中准备好的15ml无菌离心管，轻轻吹打混匀；

7、将离心管内细胞悬液，按实验需求接种于实验器皿内（注意接种密度不低于2×104/cm2），放于37度CO2恒温培养箱内，静置培养24h，更换新鲜换培养基（注意贴壁细胞、悬浮细胞不同操作方法）。　　

　　三、细胞复苏注意事项

1、整个复苏过程要尽量快，溶解时间太长可能影响复苏效果；

2、已溶解的冻存细胞尽量短时间的在常温存放，尽快稀释或者离心去除DMSO；

3、由于“化冰”这一步里冻存管与水温差太大，尤其是液氮里拿出来的冻存管，放到水里可能会造成翻江倒海的既视感，所以可以用镊子夹住冻存管往水里摁，这样即使有炸裂的情况也会有水做缓冲；

4、取冻存管时要谨防冻伤，尤其是夏天，尽管热也最好穿长袖白大褂；

5、离心这一步也可以在冻存管里的冰融化后直接进行，也就是直接把冻存管离心，离心后弃去原来的冻存液，然后直接加完全培养基重悬细胞，接着把细胞转到培养皿/瓶里培养。这种方法也许不能将DMSO清除得很干净，但是基本影响不大；

6、 复苏第二天记得去看看细胞，如果状态还不错的话就说明复苏成功。

原代细胞传代方法

原代细胞是指从机体的组织(如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等)经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。

　　一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。在人工条件下使其原代细胞生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

　　那么关于原代细胞的传代培养，我们应该怎么做呢?一般有以下两种方法：

　　一、贴壁细胞的消化法传代

　　1、吸除或倒掉瓶内旧培养液。

　　2、加入1ml左右消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)轻轻摇动培养瓶，使瓶底细胞都浸入溶液中。

　　3、消化2-5分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时，弃去消化液，加入培养液终止消化。

　　4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中继续培养。第二天观察贴壁生长情况。

　　二、悬浮细胞的传代

　　1、直接传代

　　① 让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2-2/3。

　　② 用吸管吹打形成细胞悬液后，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中培养。

　　2、离心法传代

　　① 将细胞连同培养液一并转移到离心管内，离心800-1000rpm，5分钟。

　　② 去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液。

　　③ 将细胞悬液分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中培养。

原代细胞培养过程中的常见问题

原代细胞与细胞系有什么区别?

　　根据传统定义，自组织第一次收获和接种的细胞被称为原代细胞 [Freshney, R.I. (1987). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. (New York, Alan R. Liss, Inc.)]. 这类细胞直接从组织分离，生命周期有限，经数次传代后会逐渐停止生长。原代细胞在有限的生命周期内需掌握好细胞的最大生长空间，以保持细胞群中基因型和表型的一致性。

　　细胞系是不断生长、分化的细胞群，因其经过遗传改造，致使其具有无限增长的潜能。体外生长的细胞系用于医疗或科研。

　　倍增和代数有什么区别?

　　倍增是培养物中细胞总数的翻倍，通常是指细胞指数或对数生长期。代数是指细胞群从培养瓶中移出，传代培养过程的次数，传代培养的目的，是使细胞处于低密度以刺激其进一步生长。

　　接收到的冻存细胞该如何处理?

　　收到包装箱后，立即将冻存细胞从干冰移入液氮中冻存。此过程尽量快，以避免升温。不要将细胞储存在-80℃，这样会对细胞造成不可挽回的伤害。

　　冻存的细胞该如何开始培养?

　　(1) 将一管细胞从液氮罐中取出，注意保护手和眼睛。

　　(2) 将冻存管快速的放入37℃水浴中，轻轻握住并旋转，直到管内物体完全融化。

　　(3) 将冻存管立即从水浴中拿出，擦干，转入无菌环境。

　　(4) 用70%的酒精冲洗冻存管，然后擦去多余酒精。

　　(5) 打开盖子，注意手指不要碰到里面的螺纹(注意，由于冻存管有负压，开盖时可能会有少量溢出，这是正常现象)。

　　(6) 用多聚赖氨酸(或参照说明书)包被培养瓶。多数细胞推荐的接种密度为每平方厘米5000个细胞。

　　(7) 盖好培养瓶的盖子，轻轻摇晃培养瓶以使细胞分布均匀。若需要气体交换可打开盖子。

　　(8) 将培养瓶放入培养箱中(37℃，5%CO2，95%空气)

　　(9) 放入培养箱后第6-16小时更换一次培养基，以去除残留的二甲基亚枫和未贴壁的细胞。

　　细胞培养过程中，多久更换一次培养基?

　　这取决于细胞生长的速度。一般而言2-3天更换一次培养基，许多细胞培养实验室通常在周一，周三，周五更换培养基。

　　注意：冻存细胞复苏后，在6-16小时内更换培养基，以去除残留的二甲基亚枫和死亡的细胞。

　　可以扩增培养和再次冻存原代正常人类细胞吗?

　　这取决于细胞的类型。一些细胞类型像神经细胞，神经胶质细胞和一些生长缓慢的上皮细胞，不推荐扩增培养和再次冻存。其它的细胞类型像成纤维细胞、星形细胞、肾系膜细胞、星形胶质细胞等等，可以扩增培养和再次冻存。

　　然而，需要注意的是再次冻存的过程可能导致细胞生长性能的改变。

　　培养瓶中应该加入多少体积的培养基?

　　我们推荐的用量为：T-25培养瓶5ml，T-75培养瓶15ml，T-150培养瓶30ml。